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丙酮酸鈉的作用,兩個作用早瞭解

丙酮酸鈉是溶于水, 加入氫氯化鈉之後會出現中和反應, 加入乙醇會出現丙酮酸鈉結晶。 一般來說丙酮酸鈉需要儲存於陰涼、通風的庫房, 遠離火種、熱源等等。

一、液體配製

1.胰蛋白酶液(0.25%)

2.稱取所需胰蛋白酶2.5g

3.加入無Ca2+、Mg2+液體(D-Hanks液)1000ml

4.磁力攪拌混勻, 使其完全溶解

5.過濾、除菌、分裝備用

6.D-Hanks液

7.準確稱量NaCl 8.00g、KCl 0.40g、Na2HPO4.H2O 0.06g、KH2PO4 0.06g、NaHCO30.35g;

8.依次將各成分溶解於800ml三蒸水中。 溶解時必須待一種試劑完全溶解後, 再加入 下一種試劑, 直至所有試劑溶解後混勻;

9.酚紅用5.6%NaHCO3將之溶解;

10.補加水至1000ml混勻;

11.分裝鹽水瓶內, 8磅10~20min高壓蒸汽消毒滅菌, 4℃冰箱內保存備用。

12.用水配製7.4% NaHCO3溶液, 過濾除菌, 分裝備用;

13.用無菌NaHCO3溶液調節Hanks液pH值7.2~7.4。

14.以去離子水稀釋DNA酶Ⅰ至200 u/ml,過濾除菌備用。

15.90%Percoll: (9份Percoll:1份9.0% NaCl)

16.DMEM-H-G:(DMEM培養液、25mM HEPES、25mM葡萄糖)

17.台盼藍液:稱取4g台盼藍, 加少量蒸餾水研磨, 加雙蒸水至100ml, 用濾紙過濾, 4℃冰箱內保存備用, 使用時以PBS稀釋至0.4%。

二、滋養層細胞分離純化實驗方法

取剖腹產術後的無菌胎盤組織, 在無菌條件下剪取蛻膜層與羊膜層之間的絨毛組織, 以無菌生理鹽水反復洗滌三次, 修剪以去掉連接的組織、血管等得到柔軟的絨毛, 大約30g。 將絨毛組織剪碎至1~3mm3, 並盡可能去除肉眼可見的小血管及纖維連接成分。

1.胰蛋白酶消化

將絨毛剪碎至2~3mm3左右的小塊;

100mL 0.25%胰蛋白酶、15U/ml DNA酶Ⅰ37℃消化30min, 每隔5~10min搖動一次;

(吹打)消化產物, (吸取消化液)經100目不銹鋼篩網過濾後, 濾液加入50ml離心管內(加入10%FCS), 1000rpm/min離心5min, 棄上清;

以含20%胎牛血清DMEM培養液重懸沉澱;(37℃孵箱中)

2.未消化組織重複消化兩次;

收集三次細胞懸液, 調整細胞濃度至1×106/ml(不必非常嚴格, 只要不是過少), 鏡下檢查細胞呈單個細胞分佈。

此時可接種至培養瓶中培養, 如果有細胞成活繼續以下實驗, 便於分析原因。

3.Percoll等密度梯度沉降法分離得到純滋養層細胞

製備密度梯度 用9.0%NaCl與Percoll以1:9混合, 以達到生理性滲透壓, 再以0.9%NaCl稀釋為45%和35%兩個濃度, 按濃度從大到小將兩個不同密度的Percoll溶液逐層緩慢加入10ml離心管內, 每個濃度3ml。

加樣 用吸管吸取3ml細胞懸液(含4×107個細胞-----不必非常嚴格),

小心加在10ml離心管頂層的分離介質上面。

分離 室溫下以2500r/min離心20min

離心後分為3部分 底層為RBC、少量多形核WBC, 頂層為組織連接成分、小血管、絨毛碎片, 中層為相對一致的單個核細胞

收集 用吸管吸取雲霧狀的中層置於一50ml離心管內, DMEM稀釋4倍, 1000rpm/min離心10min, 棄上清, 以含20%胎牛血清、100u/ml慶大黴素、25mMol/L HEPES的高糖型DMEM培養液重懸沉澱。

4.細胞培養

將所得的細胞懸液濃度調整至5~6×105/ml, 置於培養瓶或預先置有蓋破片的六孔培養板內37℃, 5%CO2孵箱內培養。 每24h更換培養液1次。 (第一次換液時用培養液洗兩次, 以去除細胞碎片、內源激素;換液之前在倒置相差顯微鏡下檢查細胞貼壁和細胞形態。 )

細胞活力檢測(台盼藍排斥試驗)